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酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)實驗操作重點(diǎn)之一加樣解讀
點(diǎn)擊次數(shù):94 更新時間:2025-01-07

         酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISA是免疫學(xué)和分子生物學(xué)中廣泛使用的實驗室技術(shù)。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理,對待測抗體或者抗原進(jìn)行分析測定的方法,酶聯(lián)免疫吸附分析(下稱ELISA)是免疫分析的一種,分三個部分組成:免疫識別,信號輸出和數(shù)據(jù)處理。

試劑盒原理圖.png

                                                   

       ELISA實驗測定操作簡單,一般涉及到樣本的收集保存、試劑準(zhǔn)備、加樣、溫育、洗板、顯色、結(jié)果判斷和結(jié)果報告及解釋等方面,其中任一步驟的不當(dāng)都會影響測定結(jié)果,且尤以加樣、溫育和洗板等步驟為甚。

一、ELISA實驗加樣過程:

ELISA實驗中一般需要 4 次加樣,即加樣本、加檢測抗體、加底物和加終止液。

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                                             ELISA加樣

● 實驗室使用的微量加樣器應(yīng)注意保養(yǎng)并定期校正。ELISA比較敏感,每孔加入液體量誤差會導(dǎo)致最后讀數(shù)差別,因此避免儀器帶來誤差。

●  加樣前,溶液充分混勻,加樣時不可90度向孔中滴加液體,否則會導(dǎo)致液體殘留在吸頭上,加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為45度,吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。

●  加樣品時,單孔用量要求:≥50ul/指標(biāo),如需要做復(fù)孔則所需樣本量≥100ul/指標(biāo)。如果樣本量不充足,具體用量可咨詢您的專屬銷售。

●  加樣時速度不可過快,否則無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。

●  加樣時避免液體濺出,如有樣本濺出,應(yīng)用吸水紙輕輕拭干,并做相應(yīng)記錄。

●  每次加樣順序一致,尤其底物、終止液順序一致,保證每個孔顯色時間相同。

●  加完顯色液后,放入一個可推拉的抽屜內(nèi),就可以避光振蕩了。


二、ELISA實驗加樣技巧:

●  用一張寫滿字的紙,字越多越好,比如報紙,墊在下面,這樣,加過標(biāo)本的小孔看過去下面的字會變小,沒加的字正常,非常容易區(qū)分。

●  可以利用液面反光與沒有加的孔加以區(qū)別。


三、ELISA實驗加樣問題解答:

以下問題可能因多種原因引起,本文僅討論加樣的解決方法:

Q 同一個樣本間的各個復(fù)孔的讀數(shù)有顯著性差異?

A 加樣量多少不一,操作時間長短不一。重復(fù)同一樣本時,加樣量與加樣時間理應(yīng)相同,同時也應(yīng)注意移液器的校準(zhǔn)。加樣后可輕微晃動酶標(biāo)板使反應(yīng)液充分混合。

Q 陽性對照讀數(shù)不正常?

A 加樣量不正確。應(yīng)保持每次加樣的步驟不要有太大的差異,有條件的應(yīng)該考慮使用排槍。

Q 血清本底高?

A 加樣時使用同一槍頭、交叉污染。每次吸樣注意更換吸頭,做到一樣一吸頭,避免交叉污染。

Q 實驗的標(biāo)準(zhǔn)曲線和測定的重復(fù)性差?

A 1. 可能原因:加樣本及試劑量不準(zhǔn);孔間不一致;校正移液器,吸嘴要配套,裝吸嘴時要緊密;重復(fù)某一樣品時,加樣時間盡可能與第一次接近;重復(fù)測定標(biāo)本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;樣品稀釋前應(yīng)充分混勻。

2. 可能原因:加樣過快,孔間發(fā)生污染;重復(fù)測定標(biāo)本,操作條件、人員等應(yīng)盡可能與上次保持一致,以排除這些因素造成的不一致的可能性;加樣不要過快。

3. 可能原因:加錯樣本;檢查記錄和試劑,是否加錯樣本。

4. 可能原因:加樣本及試劑時,加在孔壁上部非包被區(qū);加樣槍頭不要貼壁。


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